15 лет назад ученые приблизились к созданию лабораторного «светового оружия»: оказывается, можно научить клетки реагировать на свет и управлять ими с помощью фонаря. Попробуем разобраться в том, чем удобны оптогенетические методы и как бактерии помогли ученым лечить больных диабетом мышей с помощью смартфона.
Точность — вежливость королей
Чем дальше развивается медицина, тем сильнее она стремится к точному и целенаправленному воздействию на организм. Старые добрые методы вроде кровопускания или ртути остаются в прошлом, в современном мире стоит задача действовать избирательно на конкретные группы клеток. Например, заставить выделять инсулин клетки поджелудочной железы (и только их, а не клетки, скажем, глаза или кости). Или стимулировать определенный участок головного мозга. Такие же вопросы стоят и перед исследователями, изучающими конкретные процессы в организме или в сложных клеточных культурах. Чем точнее мы учимся управлять физиологией выбранных групп клеток, тем понятнее, как именно эти клетки работают и кто из них участвует в развитии заболеваний.
Уже довольно долго эти задачи решаются либо с помощью веществ, действующих только на определенные типы клеток (но не в каждом случае их удается подобрать), либо путем генной инженерии. Можно «кормить» клетки дополнительной генетической информацией и заставлять их производить нетипичные для них белки или, наоборот, выключать уже работающие в клетках гены. Однако ни один из методов не позволяет контролировать происходящее. Например, не получается резко прекратить воздействие на клетки, если что-то пошло не так; не всегда удается дозировать сигнал, варьировать его во времени и пространстве и исключать побочные эффекты. А хотелось бы уметь встраивать в клетки какой-то выключатель и активировать его с помощью стимула, безопасного как для самих клеток, так и для их окружения. Такой стимул придумали в 2002 году — им оказался свет.
Я вижу свет!
В человеческом организме на свет могут отвечать только специализированные фоторецепторные клетки — палочки и колбочки, находящиеся на сетчатке глаза. Остальные клетки напрямую на свет не реагируют, поэтому приходится обращаться за помощью к генной инженерии и встраивать в них дополнительные светочувствительные белки. Попробуем разобраться в том, как эти белки работают.
В наших фоторецепторах за реакцию на свет отвечают белки опсины. С ними связан ретиналь — альдегид витамина А. Улавливая фотон, он получает дополнительную энергию, перестраивает химические связи в своем длинном «хвосте» и изменяет форму. Из-за этого изменяется структура всей молекулы, и она получает возможность взаимодействовать с другими молекулами. С помощью нескольких посредников опсин посылает сигнал ионному каналу на мембране клетки. В норме открытый, после получения сигнала канал закрывается, и внутрь перестают поступать ионы натрия.
Изменение структуры ретиналя под действием света и при возвращении в темноту. Связь между 11-м и 12-м атомом углерода меняется из цис-конформации в транс- и обратно. Изображение: P. Mahmoudi et al., 2017 / CC BY-NC-SA 3.0
Палочки и колбочки — видоизмененные нейроны, поэтому обладают возбудимостью и проводимостью. На языке нервной системы возбуждение — это изменение количества ионов (то есть заряженных частиц) вокруг мембраны нейрона. Когда ретинол ловит фотон и закрывается ионный канал, положительно заряженные ионы натрия перестают поступать в клетку, их количество внутри уменьшается. Следовательно, заряд вокруг мембраны изменяется, и возникает сигнал, который фоторецепторы передают другим клеткам, а те, в свою очередь, пересылают его дальше, к зрительным центрам мозга.
Микробы спешат на помощь
Однако для оптогенетических задач наши собственные опсины оказываются в целом бесполезны. Опсины палочек улавливают свет всего видимого спектра (а ученым обычно хочется иметь более специализированные белки, например, чтобы разные клетки активировать разным светом), а белки колбочек недостаточно чувствительны. Кроме того, не любую клетку организма можно активировать путем закрытия ионного канала. Это работает, если мы имеем дело с нейронами, но если, например, мы хотим, чтобы клетка по сигналу выделяла какой-нибудь белок или запускала работу конкретного гена, то нам нужны другие типы светочувствительных белков, которых в нашем организме нет.
На помощь приходят наши маленькие (а то и микроскопические) и невероятно далекие родственники. Аналоги родопсинов обнаружены у дрозофилы, а также бактерий и одноклеточных водорослей. Помимо этого, светочувствительные белки с разнообразными функциями встречаются также у грибов и высших растений. Некоторые из них обладают большей избирательностью, чем наши белки, например, реагируют только на синий свет или на ультрафиолет (который мы не видим вообще). Другие воспринимают красный свет, который хуже поглощается обычными клетками, поэтому легче проникает сквозь них в глубокие слои ткани (это важно, если мы хотим управлять клетками в глубине мозга). Наконец, некоторые белки оказываются гораздо чувствительнее наших, и способны улавливать минимальные количества света, что позволяет избежать перегрева окружающих тканей.
Щедрые доноры светочувствительных белков: вольвокс, гриб Leptospaheria maculans, хламидомонада, овес посевной, арабидопсис, галобактерия. Изображения: Frank Fox / Wikimedia Commons / CC BY-SA 3.0 DE, Ralph Lange / Flickr / CC BY 2.0, Dartmouth Electron Microscope Facility / Public domain, H. Zell / Wikimedia Commons / CC BY 3.0, Alberto Salguero Quiles / Wikimedia Commons / CC BY-SA 3.0, NASA / Wikimedia Commons / Public domain
Это один из характерных случаев, когда становится ясно, кому нужна фундаментальная наука. Зачем, казалось бы, изучать светочувствительный глазок хламидомонады, когда кругом столько более насущных проблем? Но именно хламидомонада оказывается обладателем уникального белка, который однажды стал необходимым для множества прикладных исследований.
Антенны на голове и свет в окне
В общем виде оптогенетическая технология выглядит следующим образом: ученые подбирают нужный им светочувствительный белок, с помощью методов генной инженерии доставляют его в определенную группу клеток, а затем к нужному месту подводят провод с диодом на конце, который можно включать и выключать, наблюдая за происходящим с клетками или животным в целом (современные технологии позволяют имплантировать провод так, чтобы он не мешал животному передвигаться и не доставлял дискомфорта).
Стимуляция центрального ядра миндалевидного тела мыши заставляет ее охотиться на неживые предметы
С помощью такой технологии можно, например:
Избирательно стимулировать группы нервных клеток и получать данные об их функциях. Так, недавно «Чердак» писал о мышах, которые «пили» синий свет. В клетки их рецепторов, отвечающих за восприятие кислого вкуса, встраивали светочувствительные белки, восприимчивые к синей области спектра. Сначала мышей приучали пить из носика поилки обычную воду, а потом вставили в носик синий диод, а воду убрали. Свет активировал рецепторы кислого вкуса, а мыши, испытывающие жажду, лизали носик поилки так же активно, как будто там была настоящая вода. Это позволило сделать вывод о том, что они чувствуют воду с помощью «кислых рецепторов».
Лечить заболевания мозга. Ученым удалось добиться существенного улучшения состояния мышей, перенесших инсульт. Давно было показано, что электрическая стимуляция мозга способствует его восстановлению, но оставалось неизвестным, за счет каких клеток и взаимодействий. Оказалось, что можно избирательно включать клетки латерального ядра мозжечка, которые посылают возбуждающие импульсы к моторным и чувствительным областям переднего мозга. После такой точечной стимуляции мыши стали гораздо лучше проходить поведенческие тесты, и эти результаты сохранялись даже по окончании терапии.
Определить область, ответственную за кокаиновую зависимость. Мышам давали несколько доз кокаина, чтобы сформировать привычку. А также встраивали светочувствительные белки в нейроны префронтальной коры. При активации этих нейронов мыши с меньшей охотой употребляли кокаин, а при подавлении их, наоборот, с жадностью на него набрасывались. Судя по всему, кокаин действует именно на эту группу клеток, а активация ее ведет к сопутствующему получению удовольствия.
Создавать фальшивые воспоминания. Ученые из Англии и США помещали мышей в разные комнаты и действовали на участки гиппокампа, который связан с формированием памяти. Например, в первый раз их помещали в комнату, А и замечали, какие области гиппокампа активны. В следующий раз их помещали в комнату В (по-другому раскрашенную) и действовали стрессовым фактором (удар током), но светили при этом на нейроны, которые перед этим были активны в комнате А. Нейроны активировались, формировалось воспоминание. Когда после этого мышей помещали в комнату А, они вели себя испуганно, хотя стрессу там на самом деле не подвергались.
Однако с более крупными млекопитающими дело обстоит сложнее. Так, например, группа американских ученых, работавшая с макаками, столкнулась со следующей проблемой: мозг приматов окружен тремя оболочками, при этом наружная из них — твердая оболочка, или dura mater, — довольно прочная и непрозрачная. При инъекции вируса со светочувствительным белком и имплантации провода попытки проникнуть сквозь нее часто ведут к повреждению мозга. К тому же, из-за толщины оболочки и сложной трехмерной архитектуры мозга, бывает непросто точно направить луч света на интересующую область. Решением этой проблемы стало настоящее окно в мозг: часть твердой оболочки заменили на прозрачную нейлоновую пленку, не нарушающую работу мозга, и наконец-то появилась возможность буквально в прямом эфире наблюдать, как работает оптогенетика.
Беспроводные мыши
Во всех вышеперечисленных экспериментах речь шла о нейронах, причем, по большей части, лежащих близко к поверхности. Но что делать, если нас интересуют клетки, находящиеся внутри организма? Например, мы хотим построить систему, генерирующую инсулин по световому сигналу. Понятно, что выделять его под кожей бессмысленно, поэтому активируемые клетки должны располагаться сильно глубже. Но в таком случае встает вопрос о том, чем на них светить и как управлять светом. Ученые из Китая и Швейцарии разработали хитрую беспроводную систему, которая позволяет избежать постоянных манипуляций с организмом.
Они взяли культуру клеток, которую «обучили» под действием дальнего красного света выделять инсулин. Это были не нейроны, а клетки почки со встроенной сложной генно-инженерной конструкцией. Модифицированные клетки поместили в капсулы из биополимеров, и вместе с ними «упаковали» небольшие красные диоды, активируемые удаленно специальным контроллером. Капсулы имплантировали в брюшную полость мышей, больных диабетом. Таким образом, источник света оказался замурован в непосредственной близости от клеток.
Вся система целиком работает следующим образом. Исследователь с помощью глюкометра определяет уровень сахара в крови животного. Глюкометр автоматически передает эту информацию на смартфон, где установлено специально разработанное приложение, и на контроллер. При высокой концентрации сахара контроллер автоматически запускает диоды. В то же время приложение на смартфоне позволяет корректировать индивидуальную дозу и более точно регулировать процесс, посылая сигналы контроллеру через интернет. В результате диоды испускают красный свет, он падает на клетки, а они в ответ выделяют инсулин, который проникает сквозь поры в оболочке капсулы и попадает в кровь. Результат — уровень сахара в крови мышей-диабетиков падает.
Все эти небольшие эксперименты постепенно приближают нас к персонализированной дистанционной медицине. В идеальном раскладе человек должен научиться сам или с помощью простейших приборов измерять различные показатели состояния собственного организма. Приборы будут отправлять результаты измерений врачу (или специальному приложению, если решение врача не требуется), а врач (или приложение) сможет послать световой сигнал отдельным группам клеток и изменить их активность. Вот так, без лишних операций, консультаций и очередей, должно выглядеть настоящее светлое будущее.
По информации http://nauchkor.ru/media/svetloe-buduschee-optogenetika-dlya-chaynikov-596272d95f1be7747c059da7
Обозрение "Terra & Comp".
